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【應(yīng)用】 Coriolis μ收集、提取空氣中TNA

發(fā)布人: 來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2025-02-14 16:43:11


研究背景


本研究聚焦于從大體積空氣樣本中提取和純化總核酸(TNA),這些樣本通過(guò)Bertin Technologies開(kāi)發(fā)的生物氣溶膠采樣器Coriolis μ采集。隨后,使用Promega的Maxwell? RSC環(huán)境總核酸試劑盒和Maxwell? RSC自動(dòng)核酸提取儀處理這些樣本,然后用于分析空氣中存在的病毒和細(xì)菌。
研究的目標(biāo)是展示這一工作流程的有效性,包括Coriolis μ空氣采樣器用于空氣采樣,以及Maxwell?系統(tǒng)用于大體積空氣樣本中的核酸純化,適用于環(huán)境和病原體檢測(cè)場(chǎng)景。


研究方法


1.使用Coriolis μ以300L/min的空氣流量,收集液采用PBS或VTM,體積為15ml,采樣持續(xù)10分鐘。
2.將每個(gè)樣本1.2ml無(wú)核酸酶水預(yù)熱至60°C,持續(xù)2-5分鐘,用于PureYield?結(jié)合柱的洗脫。
3.將收集的液體轉(zhuǎn)移到50ml Falcon管中。大約提取了10ml樣本(對(duì)于其他樣本體積,相應(yīng)地調(diào)整蛋白酶溶液、結(jié)合緩沖液和異丙醇的體積)。
4.根據(jù)表1添加適當(dāng)體積的蛋白酶溶液。
5.充分混合后,室溫下孵育30分鐘。
7.添加適量的異丙醇,充分混合。
8.按照Maxwell? RSC環(huán)境總核酸試劑盒技術(shù)手冊(cè)(TM663)第4A節(jié)“提取和純化”步驟,繼續(xù)進(jìn)行操作。


研究結(jié)果


Maxwell? RSC環(huán)境總核酸試劑盒與Maxwell? RSC儀器成功用于從通過(guò)Coriolis μ采集的PBS或VTM空氣樣本中純化可擴(kuò)增的病毒RNA,這些樣本中加入了滅活的流感B型病毒(FluB)和SARS-CoV-2(圖1)。
RT-qPCR檢測(cè)通過(guò)Coriolis μ采集的PBS或VTM空氣樣本中的SARS-CoV-2(SC2)和流感B型病毒RNA。空氣樣本使用Coriolis μ在PBS(點(diǎn))或VTM(方)中收集,并加入滅活病毒,使用高劑量(每個(gè)樣本2×10^5個(gè)流感B、2×10^4個(gè)SARS-CoV-2)或中劑量(高劑量的1:10)。通過(guò)Maxwell? RSC儀器使用Maxwell? RSC環(huán)境總核酸試劑盒進(jìn)行總核酸純化,并進(jìn)行三次重復(fù)。每個(gè)洗脫液5μl進(jìn)行A. GoTaq? Enviro廢水SARS-CoV-2雙靶標(biāo)系統(tǒng)(E和N2)或B. GoTaq? Enviro RT-qPCR系統(tǒng)(Cat.# AM2010)與流感B型引物的擴(kuò)增。
同樣,Maxwell? RSC環(huán)境總核酸試劑盒和Maxwell? RSC儀器成功用于從PBS中采集的空氣樣本中純化細(xì)菌DNA。純化的DNA通過(guò)16S V3/V4宏基因組測(cè)序進(jìn)行分析。加入微生物群體標(biāo)準(zhǔn)時(shí),檢測(cè)到預(yù)期的細(xì)菌物種和屬(圖2)。此外,一些文獻(xiàn)中僅在空氣樣本中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌屬,包括Acinetobacter、Brevibacterium、Brevundimonas、Corynebacterium、Dermacoccus、Enhydrobacter、Kocuria、Micrococcus、Pseudomonas、Rhizobium、Streptococcus,以及本研究中獨(dú)有的Gardnerella、Nesterenkonia和Stenotrophomonas也在本研究中檢測(cè)到。
從空氣樣本中純化的細(xì)菌DNA的分類分布??諝鈽颖臼褂肅oriolis μ在PBS中采集,加入75μl ZymoBIOMICS?腸道微生物群標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行加樣。通過(guò)Maxwell? RSC儀器使用Maxwell? RSC環(huán)境總核酸試劑盒進(jìn)行總核酸純化。使用GoTaq?長(zhǎng)PCR主混合物(Cat.# M4021)進(jìn)行所有擴(kuò)增步驟,并使用ProNex?尺寸選擇性純化系統(tǒng)(Cat.# NG2001)進(jìn)行所有純化步驟。測(cè)序文庫(kù)的制備遵循Illumina 16S宏基因組測(cè)序文庫(kù)制備指南,使用ProNex? NGS文庫(kù)定量試劑盒(Cat.# NG1201)進(jìn)行文庫(kù)定量。文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化并合并,使用Illumina MiSeq儀器進(jìn)行測(cè)序,并采用V3 600-cycle試劑盒。使用mothur(Schloss, P.D.等,2009)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

(圖一)

(圖二)



結(jié)論


結(jié)果表明,Maxwell? RSC環(huán)境總核酸試劑盒和Maxwell? RSC自動(dòng)核酸提取儀成功地從通過(guò)Coriolis μ采集的空氣樣本中純化了病毒RNA和細(xì)菌DNA。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)確認(rèn)了SARS-CoV-2和流感B型病毒的存在,而細(xì)菌DNA則通過(guò)宏基因組測(cè)序進(jìn)行分析,揭示了空氣樣本中常見(jiàn)的細(xì)菌種類。                
本研究強(qiáng)調(diào)了Coriolis μ采樣器在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用潛力,并展示了分析方法的穩(wěn)健性,預(yù)示著環(huán)境監(jiān)測(cè)的前景。

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